新法可快速检测埃博拉病毒

  科技日报北京9月30日电 (记者刘岁晗)美国研究人员近日完成的一项原则证明性研究称,基于DNA排序的实时血液检测,可迅速对埃博拉出血热、基孔肯雅热等危重传染病进行诊断。研究人员表示这项检测未来有望用于实验场地和医疗设施缺乏的地区。

  大多数商用或科研用基因诊断是以特定的病原体为目标。但美国加州大学旧金山分校检验医学副教授查尔斯·邱(音译)领导的研究团队开发出的新检测技术,则不要求预先识别出嫌疑病原体。这种在临床所有DNA样本中不知道哪种是正在被拿来检测的公正无预判的分析手段,被称为元基因组分析法,已用于对埃博拉病毒的检测。

  去年,运用这种方法,该研究团队检测了一名来自威斯康星州患有严重脑炎的男孩脊髓液中的所有DNA样本,诊断出了一种罕见的病毒,在医学界引起了强烈反响。但当时诊断费时两天。此次,研究团队对两位来自非洲的埃博拉患者储存血液样本中的遗传指纹进行检测。整个诊断过程持续五小时,而DNA测序本身才花费了10分钟。在本次检测中,研究人员开发了可在笔记本上使用的分析和可视化软件,并利用了新兴的DNA测序技术——纳米孔测序技术来辅助实验,大大提高了获取实验结果的速度。

  纳米孔测序技术是DNA第四代先进的测序技术。该技术通过测量对不同核酸通过纳米孔时对电流产生的微弱扰动差异,来识别不同碱基。纳米孔测序装置不仅体积小,携带方便,还可以实时、直接生成实验数据,使基因测序过程变得迅速了许多。

  研究团队还检测了波多黎各正在暴发的基孔肯雅热的致病病毒。他们从一位并未表现出任何症状的当地献血者的血液样本中迅速检测到了基孔肯雅病毒,该献血者终报告发烧并伴有关节疼痛。

  查尔斯·邱指出,将纳米孔测序技术运用于实时元基因组检测病原体的方法,将为传染病诊断带来根本上的改变。

  结构形态

  埃博拉病毒(EBoV)属丝状病毒科,长度为970纳米,呈长丝状体,单股负链RNA病毒,有18959个碱基,分子量为4.17×10⁶。外有包膜,病毒颗粒直径大约80nm,大小100nm×(300~1500)nm,感染能力较强的病毒一般长(665~805)nm左右,有分支形、U形、6形或环形,分支形较常见。有囊膜,表面有(8~10)nm长的纤突,纯病毒粒子由一个螺旋形核糖核壳复合体构成,含负链线性RNA分子和4个毒粒结构蛋白。较长的奇形怪状的病毒粒子相关结构可呈分枝状或盘绕状,长达10微米。来自刚果(金)、象牙海岸和苏丹的埃波拉毒株其抗原性和生物学特性不同。

  “埃博拉”病毒的形状宛如中国古代的“如意”,利用电子显微镜对埃博拉病毒属成员的研究显示,其呈现一般纤维病毒的线形结构。病毒粒子也可能出现“U”字、“6”字形、缠绕、环状或分枝形,不过实验室纯化技术也可能是造成这些形状产生的因素之一,例如离心机的高速运转可能使病毒粒子变形。病毒粒子一般直径约80纳米,但长度可达1400纳米,典型的埃博拉病毒粒子平均长度则接近1000纳米。在病毒粒子中心结构的核壳蛋白由螺旋状缠绕之基因体RNA与核壳蛋白质以及蛋白质病毒蛋白VP35、VP30、L组成,病毒包含的糖蛋白从表面深入病毒粒子10纳米长,另外10纳米则向外突出在套膜表面,而这层套膜来自宿主的细胞膜,在套膜与核壳蛋白之间的区域,称为基质空间,由病毒蛋白VP40和VP24组成。

  EBOV在常温下较稳定,对热有中等度抵抗力,56℃不能完全灭活,60℃30min方能破坏其感染性;紫外线照射2min可使之完全灭活。对化学药品敏感,乙醚、去氧胆酸钠、β-丙内酯、福尔马林、次氯酸钠等消毒剂可以完全灭活病毒感染性;钴60照射、γ射线也可使之灭活。EBOV在血液样本或病尸中可存活数周;4℃条件下存放5周其感染性保持不变,8周滴度降至一半。-70℃条件可长期保存。

  EBOV的自然宿主虽尚未后确定,但已有多方证据表明猴子及猩猩等野生非人灵长类动物以及其他动物有EBOV感染现象。证据1:1976年、1996年、2002年的流行,源于人类接触野外死亡的猩猩;证据2:菲律宾出口的猴子多次查出EBOV,但没有发现发病;证据3:2003年8月刚果(布)卫生健康部的调查表明,野外黑猩猩、野猪体内可查到EBOV。[4]

  致病原理

  第4个埃博拉毒株(Reston)能引起人以外的灵长目动物致命性的出血性疾病;文献报导有极少数人感染此病毒,临床上无症状。1976年在苏丹流行时,病死率为53.2%;在扎伊尔,高达88.8%。因此,世界卫生组织将其列为对人类危害严重的病毒之一,即“第四级病毒”。有些患者在感染埃博拉病毒48小时后便不治身亡,而且他们都“死得很难看”,病毒在体内迅速扩散、大量繁殖,袭击多个器官,使之发生变形、坏死,并慢慢被分解。病人先是内出血,继而七窍流血不止,并不断将体内器官的坏死组织从口中呕出,后因广泛内出血、脑部受损等原因而死亡。照顾病人的医生护士或家庭成员,和病人密切接触后可被感染。有时感染率可以很高,如苏丹流行时,与病人同室接触和睡觉者的感染率为23%,护理病人者为81%。医院内实验人员感染和发病也有好几起。

  埃博拉病毒主要是通过病人的血液、唾液、汗水和分泌物等途径传播。实验室检查常见淋巴细胞减少、血小板严重减少和转氨酶升高(AST>ALT),有时血淀粉酶也增高。诊断可用ELISA检测特异性IgG抗体(出现IgM抗体提示感染);用ELISA检测血液、血清或组织匀浆中的抗原;用IFA通过单克隆抗体检测肝细胞中的病毒抗原;或者通过细胞培养或豚鼠接种分离病毒。用电子显微镜有时可在肝切片中观察到病毒。用IFA检测抗体常导致误判,特别是在进行既往感染的血清学调查时。实验室研究有很大的危险性,应该只在有防护措施防止工作人员和社区感染的地方开展(4级生物安全实验室)。

  感染潜伏期为2-21天。感染者均是突然出现高烧、头痛、咽喉疼、虚弱和肌肉疼痛。然后是呕吐、腹痛、腹泻。发病后的两星期内,病毒外溢,导致人体内外出血、血液凝固、坏死的血液很快传及全身的各个器官,病人终出现口腔、鼻腔和肛门出血等症状,患者可在24小时内死亡。

  在大约1500例确诊的埃博拉案例中,死亡率高达88%。

  埃博拉是人畜共通病毒,尽管世界卫生组织苦心研究,至今没有辨认出任何有能力在爆发时存活的动物宿主,认为果蝠是病毒可能的原宿主。因为埃博拉的致命力,加上目前尚未有任何疫苗被证实有效,埃博拉被列为生物安全第四级(Biosafety Level 4)病毒,也同时被视为是生物恐怖主义的工具之一。

  尽管医学家们绞尽脑汁,作过许多探索,但埃博拉病毒的真实“身份”,至今仍为不解之谜。没有人知道埃博拉病毒在每次大爆发后潜伏在何处 ,也没有人知道每一次埃博拉疫情大规模爆发时,第一个受害者是从哪里感染到这种病毒的。“埃博拉”病毒是人类有史以来所知道的可怕的病毒之一,病人一旦感染这种病毒,没有疫苗注射,也没有其他治疗方法,实际上几近自己给自己判了死刑。用一位医生的话来说,感染上“埃博拉”的人会在你面前“融化”掉。唯一的阻止病毒蔓延的方法就是把已经感染的病人完全隔离开来。

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