梳理保存微生物组样品同时不改变多样性的方法

  在过去十年左右,研究人员已花费几十亿美元对栖息于不同地点(如人体、土壤和海洋)中的微生物进行分门别类。对这些不同的微生物组,我们所知的大多数信息都是通过日益复杂的下一代测序技术获得的。比如,科学家们通常对编码16S rRNA---细菌核糖体小亚基中的一种组分---的基因进行高通量测序来测量样品中的微生物多样性。当研究人员想要对样品内所有有机体中的所有基因都进行测序时,那么鸟枪法宏基因组(shotgun metagenomics)是一种用于微生物组研究的配套技术。这些DNA测序技术非常灵敏,能够区分污染或者危害的样品处理导致的细微变化。

  因为样品处理和储存上存在的差异能够影响一项研究的结果,所以维持现场收集到的样品的完整性是微生物组研究所面临的一项重大挑战。位于美国明尼苏达州罗切斯特市的梅约诊断博士后研究员、微生物学生态学家Vanessa Hale说,金标准方法就是立即抽取新鲜样品中DNA或RNA。当立即处理不可行时,好的方法就是将样品储存在−80 °C下。粪便样品中的微生物组成在室温放置一到两天后就开始发生变化(参照文献1和2);其他的样品,如土壤,也具有类似的温度敏感性。然而,获取一种超低温冷藏箱(ultra-low-temperature freezer)并不总是可能的。比如,研究对象可能需要在家收集粪便样品,或者研究人员可能在偏远地点收集土壤样品。在一些情形下,在对DNA和RNA进行提取和分析之前,必须将样品储存和保藏数天或数周。

  美国芝加哥大学微生物生态学家Jack Gilbert说,“微生物组是如此多样性和复杂。你做的任何一种特定事情都将改变[它的]一部分。”随着技术允许对微生物环境进行更加深入的研究,即便微生物群体的存在或相对丰度发生为微小的变化,也能够显著干扰群体比较。一种储存方法所导致的变化越少,结果就越好。

  《科学家》杂志与微生物组专家进行沟通,让读者了解如何储存样品同时保存它们的微生物多样性。

  1.确保样品均质化

  维持原始样品的保真度开始于收集的那一刻。第一步就是确保拥有均质性的样品。比利时根特大学微生物学家Kim Heylen说,“如果样品没有均质化,那就让它均质化。如果想要拥有可以复制的二次抽样样品(subsample),[这样做]是至关重要的。”

  美国加州大学戴维斯分校微生物学家、博士后研究员Holly Ganz在一家非盈利机构KittyBiome开始职业生涯,其中该非盈利机构研究野猫和家猫的微生物组,研究对象通常为它们的粪便样品。Ganz说,“粪便并不是均质性的。它存在一个问题:以粪便中哪一部分为样品将影响研究结果。” Ganz首先移除粪便的外层,这是因为外层可能含有环境污染物,接着将粪便剩余部分放入塑料袋中以便一起磨碎和混合。接下来,她将样品沿着薄板铺展开来,并且从中二次抽样样品。她说,“让粪便均质化是非常困难的,因此我只是增加我获取二次抽样样品的次数。”

  在近对人肠道微生物组的研究中,研究人员利用研钵及研杵捣碎加有液氮的粪便样品,然后将形成的粉末分配成较少的样品,转移到试管中,然后在−80 °C下冻存。相比于来自未均质化的新鲜样品的二次抽样样品,利用这种方法制备的样品在微生物组成上表现出减少的变化(参照文献3)。

  土壤具有更加复杂的基质。Gilbert建议将土壤样品放入搅拌机中尽可能地搅碎颗粒物。他说,“完全均质化是不可能的。”

  研究人员也建议在初次收集样品后,进行多次重复地等分,这是因为多次冻融循环破坏核酸质量。比如,科学家们使用无菌的一次性活检钳(biopsy punch)从一个更大的原始样品中收集几乎相同大小的冻存粪便颗粒。然后,直接将这些颗粒放入含有核酸裂解液中的提取管中。这种方法仅仅通过对原始的样品进行等分,为科学家们节省整整一次冻融循环。

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